Le projet CULTUM : Peut-on prédire la sensibilité aux médicaments de thérapie ciblée par la culture tumorale ?

En dépit de progrès thérapeutiques notables de la chimiothérapie, de l’immunothérapie et des médicaments ciblés, l’évolution des tumeurs métastatiques reste le plus souvent fatale à terme et rend compte la majorité des 155 000 morts annuelles par cancer en France. Cet échec massif est lié à la sélection darwinienne de clones de cellules cancéreuses capables de s’adapter et de résister aux différentes lignes de médicaments, cytotoxiques, hormonothérapie, ou molécules ciblées. Cette sélection est favorisée par la dérive génétique liée à la perte des mécanismes de réparation de l’ADN et de contrôle du cycle cellulaire par les cellules cancéreuses. 

Cependant, la connaissance de plus en plus précise des mécanismes de l’oncogenèse a permis le développement de médicaments ciblant des anomalies moléculaires bien caractérisées des cellules cancéreuses. La survie et la croissance des tumeurs humaines dépendent de nombreuses voies de signalisation moléculaire. Les facteurs de croissance du milieu extracellulaire agissent par le biais de récepteurs membranaires dont le signal est conduit (transduit) par des voies intracellulaires multiples et redondantes jusqu’aux effecteurs nucléaires. Les voies de transduction des signaux sont portées par des protéines, souvent des kinases qui agissent en cascade. La mutation de ces protéines génère leur auto-activation responsable d’une prolifération excessive des cellules. Les gènes mutés produisant ces protéines anormales sont appelés des oncogènes. Certaines anomalies des oncogènes dits «drivers » provoquent le fonctionnement anormal de ces voies de signalisation à l’origine des cancers, tandis que d’autres anomalies ont un rôle secondaire (mutations passengers). Les voies oncogéniques sont les objectifs plus ou moins spécifiques des médicaments de thérapie ciblée (MTC).

La limite des tests génétiques

L’identification des anomalies génomiques permet dans certains cas de sélectionner les patients qui bénéficient de médicaments ciblés comme par exemple : - les mutations du récepteur de l’EGFR rendant les cancers du poumon sensibles aux inhibiteurs de la tyrosine kinase de l’EGFR, les mutations des gènes RAS rendant les cellules de cancers coliques insensibles aux anticorps monoclonaux dirigés contre l’EGFR, les mutations du gène RAF rendant les cellules des mélanomes sensibles aux anti-RAF. Ces analyses sont entrées dans la pratique courante grâce aux plateformes d’oncogénétique moléculaire mise en place par l’INCA.

L’étude SHIVA était le premier essai randomisé à avoir évalué des thérapies ciblées non pas en fonction de l’histologie de la tumeur et donc du type de cancer (sein, poumon, foie…) mais, en fonction du profil moléculaire des tumeurs (Le Tourneau, 2015). L’essai, promu par l’Institut Curie, s’adressait à des patients atteints de tous types de cancers « biopsiables » qui avaient reçu tous les traitements standards disponibles. Après séquençage à haut débit de l’ADN des prélèvements tumoraux, les patients porteurs d’altérations moléculaires ont été randomisés pour recevoir soit une thérapie ciblée adaptée à l’altération détectée, soit une chimiothérapie classique. Parmi les 741 patients inclus dans l’essai SHIVA, 195 ont été randomisés et traités (26%). Les 546 patients restant n’ont pas été traités dans le cadre de l’étude, soit parce qu’aucune altération moléculaire n’a été détectée (445 patients), soit parce que l’état général des patients s’est détérioré (101 patients). En tout, 99 patients ont été traités dans le groupe contrôle avec des chimiothérapies, tandis que 96 patients ont été traités avec l’une des 11 MTC disponibles dans le cadre de l’étude. Il s’est avéré que la plupart des patients avaient une altération de la voie des hormones (42%) et de la voie PI3K/AKT/mTOR (46%), tandis que 12% des patients avaient une altération sur la voie des MAP kinases. Quand une cible était identifiée, les patients recevaient une des 11 molécules ciblées disponibles en 2012-2015.

Au final, la survie sans progression était identique dans le groupe thérapie ciblée et dans le groupe contrôle (2,3 vs 2 mois). Il a été retrouvé plus d’événements indésirables graves (de grade 3 ou 4) dans le groupe thérapie ciblée (43%) que dans le bras chimiothérapie (35%).

Une autre étude a été menée par UNICANCER et l’IGR pour le cancer du sein qui est caractérisé par des altérations génomiques récurrentes (Andre et al, 2014). Une analyse moléculaire par hybridation génomique comparative (CGH) et par séquençage Sanger avait pour objectif d'identifier des anomalies cibles pour des molécules adaptées. 423 patientes ont été incluses. Un ciblage potentiel d’une altération génomique a été identifié pour 297 patientes (46%), le plus souvent en PIK3CA (25%), CCND1 (19%) et FGFR1 (13%). Le traitement a pu être personnalisé pour 55 patientes (13%). Sur les 43 patients qui étaient évaluables et avaient reçu une thérapie ciblée, quatre ont eu une réponse objective et neuf autres ont eu une maladie stable pendant plus de 16 semaines. Les auteurs concluaient que la personnalisation des traitements était possible pour le cancer du sein métastatique, y compris pour les altérations génomiques rares mais il faut reconnaitre que peu de patientes ont finalement bénéficié (3 %) de cette approche lourde. L’analyse génomique reste encore insuffisante pour orienter le choix des traitements dans la majorité des tumeurs. Les tests prédictifs de l’activité des molécules ciblées restent à améliorer.

Les promesses de la culture tumorale in vitro

La technique de culture de fragments tumoraux est ancienne mais elle a déçu pour l’évaluation des médicaments de la chimiothérapie cytotoxique qui produisent une combinaison de phénomènes d'apoptose et de cytostase. De plus, la pharmacocinétique des cytotoxiques est caractérisée par leur élimination rapide du plasma avec un fort degré de variabilité individuelle.

La culture tumorale semble mieux adaptée pour l'évaluation des médicaments ciblés qui sont le plus souvent purement cytostatiques [revu par Louandre et al, 2016]. Leur pharmacocinétique est stable et leur concentration plasmatique peut être dosée. Par ailleurs, la cytostase est facile à mesurer par le biais du marquage de l'antigène Ki67 (indice de prolifération) qui caractérise les cellules en cycle (G1, S,G2 et M) et du comptage des mitoses (indice mitotique). L'utilisation de sérum autologue augmenterait la viabilité des explants cultivés [Majumder, 2015].

Une technique de culture à court terme d’explants de tumeurs humaines obtenues après exérèse chirurgicale a été mise au point au sein de l’équipe Cancer et Signalisation (Galmiche et coll. EA UPJV 4666, Amiens). Cette technique a permis d’évaluer la réponse tumorale ex vivo de carcinomes hépato-cellulaires et de tumeurs de la tête et du cou à des médicaments ciblant les principales voies de transduction du signal. La technique consiste à mesurer la diminution de la prolifération cellulaire appréciée par le marquage histologique de Ki-67 (Godin, 2013 ; Péria, 2015 ; Louandre, 2016) après 48 h de culture en présence des médicaments.

Donnadieu et al ont analysé 18 tumeurs opérées de la sphère tête et cou (2016). La prolifération cellulaire en présence de médicaments ciblés a pu être mesurée pour 14 tumeurs. Un médicament ciblé au moins entrainait une diminution de la prolifération cellulaire supérieure à 50 % pour 10 d’entre elles (figure 1). Cette expérience montre que la culture à court terme de tissu tumoral est au point dans notre équipe et qu’elle peut fournir des indications sur l’activité in vitro des médicaments ciblés.

Figure 1 : Pourcentage de marquage de l’antigène Ki67 dans des tumeurs de la tête et du cou opérées et cultivées pendant 48 h sans (control) ou avec des MTC à des concentrations pharmacologiques. * indique une réduction significative de l’indice de prolifération.

Figure 1 : Pourcentage de marquage de l’antigène Ki67 dans des tumeurs de la tête et du cou opérées et cultivées pendant 48 h sans (control) ou avec des MTC à des concentrations pharmacologiques. * indique une réduction significative de l’indice de prolifération.

Le projet CULTUM : à la recherche d’une prescription rationnelle des MTC

Son objectif est d’utiliser la culture de fragments tumoraux in vitro pour choisir les médicaments ciblés capables de freiner la prolifération tumorale et déterminer si la réponse in vitro est prédictive d’une réponse clinique. Il y aura une étude oncogénétique moléculaire parallèle permettant de détecter les mutations connues ciblables.

Il s’agit d’un essai ouvert de phase II, monobras, prospectif, promu par le CHU d’Amiens impliquant plusieurs équipes (CHU d’Amiens, Centre Lambret de Lille, CHU Cochin, Centre Baclesse de Caen, CH de Saint-Quentin, Creil et Compiègne).

Les critères d’inclusion sont :

  • Patients de plus de 18 ans
  • Porteurs de tumeurs solides avancées ou métastatiques devenues réfractaires aux traitements conventionnels : cancers du sein, du poumon, du colon-rectum, de la tête et du cou, du pancréas, du rein, de la vessie, cholangiocarcinome, hépatocarcinome, glioblastome, sarcomes, carcinomes d’origine inconnue (CUP), tumeurs rares.
  • Matériel tumoral accessible à une biopsie chirurgicale (ganglions, foie, poumon, tissu souscutané… sauf os)
  • Maladie mesurable selon les critères RECIST.
  • Intervalle minimum de 28 jours après le dernier traitement anticancéreux reçu (sauf radiothérapie antalgique)
  • Patients informés ayant donné leur consentement écrit.
  • Affiliation à un régime de sécurité sociale.

Les critères de non inclusion sont :

  • Indice de performance OMS > 2.
  • Espérance de vie < 3 mois.
  • Evolution métastatique osseuse isolée.
  • Métastases cérébrales non contrôlées.
  • Défaillance des fonctions hématologique, cardiaque, hépatique ou rénale.
  • Femmes enceintes ou allaitantes.
  •  Patients pouvant recevoir un médicament ciblé dans le cadre d’une AMM après identification d’une anomalie moléculaire.
  • Patients éligibles à autre essai thérapeutique basé sur une anomalie moléculaire identifiée

La culture d’explants tumoraux :

Cette partie du projet ne sera réalisée que par le laboratoire de biochimie du CHU d’Amiens, EA UPJV 4666 (A Galmiche) pour assurer la reproductibilité de la technique.

  • Une biopsie chirurgicale de la tumeur sera faite sous anesthésie générale. Le choix de la zone à biopsier et de la voie d’abord est confié au chirurgien. Il pourra s’agir d’une biopsie ganglionnaire, hépatique, pulmonaire, de tissu sous-cutané, pleural, péritonéal… Les biopsies sous coelioscopie et par chirurgie ambulatoire seront privilégiées. Les biopsies osseuses ne sont pas acceptées car leur section n’est pas possible sur un Vibratome sans décalcification. Les biopsies à l’aiguille sont trop petites pour réaliser la technique.
  • La biopsie stérile d’au moins 2 cm3 sera placée au bloc opératoire en milieu de transport RPMI.
  • Un fragment sera envoyé au service d’anatomie pathologique pour vérifier la nature tumorale du tissu, la cellularité tumorale et la conformité à l’histologie tumorale initiale.
  • Un fragment sera envoyé à la Plateforme d’Oncologie Moléculaire du CHU d’Amiens.
  • Du sérum autologue (20 ml) sera prélevé sur un tube sans anticoagulant et conservé à – 80°C pour faciliter la culture tumorale (Majumber)
  • La biopsie débarrassée des zones hémorragiques et nécrotiques sera coupée en tranche de 300 μm par un Vibratome.
  • Les fragments seront répartis (2 fragments par médicament) dans des plaques de culture de 48 puits. Les fonds de puits auront été couverts préalablement par des protéines matricielles (MatrigelR). Le milieu de culture sera du RPMI supplémenté par 2% de sérum autologue, 8% de sérum de veau foetal, 1 % Insulin-Transferrin-Selenium, 1 % de GlutaMAX, 1 % de pénicilline, streptomycine and amphotéricine B. La culture sera réalisée pendant 48 h en étuve à 37 °C en présence de 5 % de CO2.
  • Les médicaments ciblés seront ajoutés aux puits de culture à une concentration située dans la fourchette de celles mesurées au moment de l’état stable (plus de 5 demi-vies) dans le sérum chez patients traités par les doses journalières recommandés .
  • Seuls les médicaments sur le marché 2016 seront évalués. Les médicaments cibleront :
    • La voie des MAP kinases : cetuximab, erlotinib, afatinib, sorafenib, régorafenib, imatinib, selumetinib, trastuzumab, neratinib, crizotinib, dabrafénib,
    • La voie PI3K/AKT/mTOR : everolimus, rapamycine

Le test de culture tumorale n’est pas adapté à l’évaluation des médicaments antiangiogéniques purs, des inhibiteurs de réparation de l’ADM ou des immunothérapies

  • Des fragments tumoraux témoins (4 par plaques) seront cultivés en parallèle.
  • Après 48 h de culture les fragments seront fixés par du formol tamponné à 10 % pendant 24 h, inclus en paraffine puis coupés à 4 μm et déposés sur lame. Les tissus seront colorés par l’hématoxyline-éosine pour vérifier la présence de cellules tumorales et la conservation de l’architecture et pour compter les mitoses (indice mitotique).
  • Les coupes seront incubées avec un anticorps dirigés contre l’antigène Ki-67 qui marque les cellules en cycle. S’il y a freination de la multiplication cellulaire, il sera procédé à un marquage par des anticorps contre p-ERK et de p-AKT dont l’activité est régulée par phosphorylation lors l’activation des voies de transduction.
  • La révélation se fera par immunoperoxydase. Les lames seront photographiées. Dix champs de grossissement x 40 seront examinés par lame, il y aura 2 lames par fragment et 2 fragments par condition de culture.
  • L’interprétation microscopique visuelle semiquantitative sera complétée par l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’images (Image J) pour obtenir des variables quantitatives. Le ratio du nombre de noyaux tumoraux marqués par Ki67 sur le nombre total de noyaux tumoraux définit l’index de prolifération (IP). Le ratio du nombre de cellules tumorales en mitose par rapport au nombre total de cellules tumorales définit l’index mitotique (IM).
  • Les pourcentages d’inhibition de IP et de IM dans les fragments traités (moyenne et écarttype) seront calculés par rapport aux IP et IM des fragments témoins.

Etude génomique

Cette partie du projet sera réalisée par le laboratoire d’Oncobiologie Moléculaire du CHU d’Amiens (B.Gubler, S Trudel). L’ADN génomique sera extrait à l’aide d’un extracteur automatisé (TPS, Siemens) à partir de 2 coupes de 10 μm de tissu fixé au formol et inclus en paraffine, réalisées par le laboratoire d’Anatomie et de Cytologie Pathologique du CHU (H. Sevestre).

Les mutations seront recherchées par technologie NGS, en utilisant le panel Colon&Lung v2 (Life Technologies), couvrant 92 amplicons répartis sur 22 oncogènes. La liste complète des mutations couvertes par ce panel est retrouvée en annexe X3. Les systèmes de NGS utilisés seront l’OT2 couplé à l’Ion PGM ou l’Ion Chief couplé à l’Ion S5 (Life Technologies). L’analyse des variants sera réalisée à l’aide du logiciel Ion Reporter (Life Technologies). Les résultats de l’analyse génomique seront pris en compte dans le choix du médicament.

Les échantillons de certains patients sélectionnés en fonction des données obtenues par la culture de fragments tumoraux et par le séquençage ciblé (panel colon & lung), seront explorés de façon plus exhaustive par des approches pan génomiques, tel que la CGH-array (amplifications/ délétions), RNA-seq (transcrits de fusion), NGS avec un panel de gènes plus important.

Etude Clinique

L’étude CULTUM ne s’adresse qu’aux patients dont la tumeur est réfractaire aux traitements conventionnels (chimiothérapie, immunothérapie, hormonothérapie et autres médicaments ciblés déjà prescrits dans le cadre des AMM ou d’essais cliniques).

  • L’étude clinique est multicentrique : chaque médecin investigateur des centres participant suivra et évaluera ses patients après avoir été informé des résultats de la culture de fragments tumoraux et de l’analyse moléculaire de gènes cibles.
  • Une proposition de traitement sera faite par le comité opérationnel composé du coordonnateur de l’étude, du biologiste responsable de la culture et du biologiste moléculaire. Un médicament sera considéré comme actif in vitro s’il entraine une diminution de plus de 50 % de l’index de prolifération (IP) ET de l’index mitotique (IM) dans les fragments tumoraux traités par rapport aux fragments témoins non traités.
  • Le choix final du médicament ciblé sera laissé au clinicien responsable du patient en fonction du résultat de la culture, de l’analyse génomique et des caractéristiques du patient (antécédents, traitements antérieures, toxicités attendues…). Ce choix sera motivé et consigné dans le cahier d’observation.
  • Le médicament sélectionné sera prescrit dans les conditions des Résumés des Caractéristiques des Produits (RCP) validés par l’ANSM. Les adaptations de dose seront faites selon les règles prédéfinies par les RCP. Une adaptation de la dose pourra être proposée en fonction du résultat des dosages sériques s’ils sont disponibles. Le médicament sera poursuivi tant qu’il sera bien toléré et efficace.
  • S’il n’y a pas de médicament considéré comme efficace in vitro, un traitement métronomique par le cyclophosphamide oral sera proposé : 100 mg matin, 100 mg soir, une semaine sur 2 (Mir). Le suivi de cette cohorte de patients sera assuré dans le cadre de l’étude.
  • L’évaluation tumorale clinique sera réalisée toutes les 8 semaines par tomodensitométrie ou imagerie de résonnance magnétique en utilisant les critères RECIST 1.1 avec classement en réponse complète, réponse partielle, stabilité ou progression.
  • Une relecture centralisée de l’imagerie est prévue en fin d’étude. Les CD des examens devront être fournis au coordinateur.

Le critère de jugement principal est le Taux de Survie sans Progression à 6 mois (SSP6) chez les patients ayant bénéficié de la prescription d’un médicament ciblé guidée par la culture d‘explants tumoraux. Une SSP6 de 20 % ou plus serait considérée comme intéressante.

Les critères de jugement secondaires sont la Survie Globale et le taux de réponses complètes ou partielles selon RECIST.

Perspectives

Le projet CULTUM vient d’être soumis en lettre d’intention au PHRC et il va être déposé au CPP. Son ouverture est prévue pour l’été 2016. L’étude clinique concernera 115 patients.

Aucune étude clinique n’a encore évalué la prescription des médicaments ciblés guidée par la culture d’explants tumoraux chez des patients porteurs de cancers solides réfractaires aux traitements conventionnels. Le bénéfice à l’échelon individuel pourrait se traduire par une survie prolongée des patients participant à l’étude. A l’échelon économique, la technique permettrait de choisir selon des critères plus rationnels les médicaments ciblés qui sont chers et parfois mal tolérés.

CULTUM implique les tumeurs digestives du colon-rectum et du pancréas, les cholangiocarcinome et les hépatocarcinomes. Nous comptons sur les cliniciens pour leur participation au recrutement et au suivi des patients.

REFERENCES

André F, Bachelot T, Commo F, et al. Comparative genomic hybridisation array and DNA sequencing to direct treatment of metastatic breast cancer: a multicentre, prospective trial (SAFIR01/ UNICANCER). Lancet Oncol. 2014;15:267-74 2014

Le Tourneau C, Delord JP, Gonçalves A, et al. Molecularly targeted therapy based on tumour molecular profiling versus conventional therapy for advanced cancer (SHIVA): a multicentre, openlabel, proof-of-concept, randomised, controlled phase 2 trial. Lancet Oncol. 2015;16(13):1324-34.

Louandre C, Donnadieu J, Lachaier E, Page C, Chauffert B, Galmiche A. Personalization of the medical treatment of solid tumours using patientderived tumour explants . Int J Oncol. 2016 ;48:895-9.

Majumder B, Baraneedharan U, Thiyagarajan S, et al Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nat Commun. 2015 ; 27:6169.

Donnadieu J , Lachaier E , Peria M, Saidak S , Dakpe S , Ikoli Jf, Cyril Page , Chauffert B , Galmiche A . Short-term Culture of Tumours reveals the heterogeneous sensitivity of human head and neck squamous cell carcinoma to targeted therapies (BMC Cancer, in press)

Bruno CHAUFFERT, Antoine GALMICHE, Stéphanie TRUDEL, Nicolas PENEL – CHU Amiens